El pontificado de Pío VI estuvo marcado por una serie de desafíos significativos, principalmente derivados del regalismo de los monarcas europeos y la posterior Revolución Francesa.
Regalismo y reformas josefinas
Poco después de su ascensión, Pío VI tomó medidas para erradicar la idea galicana de la supremacía papal, que se había extendido en Alemania por Hontheim (conocido como Febronianismo).
El emperador José II de Austria, influenciado por las ideas ilustradas, prohibió a los obispos austriacos solicitar facultades de cualquier tipo a Roma y suprimió numerosos monasterios. Pío VI decidió viajar a Viena para interceder; partió de Roma el 27 de febrero de 1782 y llegó a Viena el 22 de marzo. Aunque el emperador lo recibió con respeto, el ministro Kaunitz descuidó las reglas de etiqueta. El Papa permaneció en Viena hasta el 22 de abril de 1782, logrando únicamente la promesa del emperador de que sus reformas eclesiásticas no violarían los dogmas católicos ni comprometerían la dignidad papal. José II incluso suprimió el monasterio de Mariabrunn horas después de que el Papa lo abandonara. De vuelta en Roma, Pío VI se vio obligado a protestar nuevamente contra la confiscación injustificada de propiedades eclesiásticas por parte del emperador. Cuando José II ocupó la sede vacante de Milán por su propia autoridad, Pío VI protestó solemnemente, llegando a amenazar al emperador con la excomunión. En un intento por evitar males mayores, el Papa le concedió el derecho de nombrar obispos en los ducados de Milán y Mantua, mediante un concordato fechado el 20 de enero de 1784.
El ejemplo de José II fue seguido en Toscana por su hermano, el Gran Duque Leopoldo II, y el Obispo Scipio Ricci de Pistoia. Las reformas antipapales culminaron en el Sínodo de Pistoia en 1786, donde se aprobaron las doctrinas de Jansenio y Quesnel, y se eliminó la supremacía papal. En su bula «Auctorem fidei» del 28 de agosto de 1794, Pío VI condenó los actos y, en particular, ochenta y cinco proposiciones de este sínodo.
En el Reino de las Dos Sicilias, Fernando IV se negó a aceptar los breves papales sin permiso real y reclamó el derecho a nombrar a todos los beneficiarios eclesiásticos. Pío VI se negó a aceptar a los obispos nombrados por el rey, lo que resultó en treinta sedes vacantes en el Reino de Nápoles en 1784, número que aumentó a sesenta en 1798. El rey también se negó a reconocer la soberanía papal, que había existido durante ochocientos años. Aunque el Papa hizo repetidas gestiones, el rey persistió en sus nombramientos. En abril de 1791, se llegó a un compromiso temporal que permitió cubrir sesenta y dos sedes vacantes.
Revolución Francesa y cautiverio
Tras la Revolución Francesa, Pío VI rechazó la «Constitución Civil del Clero» el 13 de marzo de 1791, suspendió a los sacerdotes que la aceptaron, proveyó en la medida de lo posible al clero exiliado y protestó contra la ejecución de Luis XVI. Francia respondió anexando los pequeños territorios papales de Aviñón y el Condado Venaissin.
La cooperación del Papa con los Aliados contra la República Francesa y el asesinato del agregado francés, Basseville, en Roma (provocado por su propia culpa), llevaron al ataque de Napoleón contra los Estados Pontificios. En la Tregua de Bolonia (25 de junio de 1796), Napoleón dictó las condiciones: veintiún millones de francos, la liberación de todos los criminales políticos, libre acceso de los barcos franceses a los puertos papales, la ocupación de la Romaña por tropas francesas, entre otras. En la Paz de Tolentino (19 de febrero de 1797), Pío VI se vio obligado a ceder Aviñón, Venaissin, Ferrara, Bolonia y la Romaña; y a pagar quince millones de francos, además de entregar numerosas obras de arte y manuscritos.
En un intento de revolucionar Roma, el general francés Duphot fue asesinado a tiros, tras lo cual los franceses tomaron Roma el 10 de febrero de 1798 y proclamaron la República Romana el 15 de febrero. Debido a la negativa del Papa a someterse, fue sacado por la fuerza de Roma la noche del 20 de febrero y llevado primero a Siena y luego a Florencia. A finales de marzo de 1799, a pesar de estar gravemente enfermo, fue trasladado apresuradamente a Parma, Piacenza, Turín, luego a través de los Alpes hasta Briançon y Grenoble, y finalmente a Valence, donde sucumbió a sus sufrimientos antes de poder ser llevado más lejos. Fue enterrado inicialmente en Valence, pero sus restos fueron trasladados a la Basílica de San Pedro en Roma el 17 de febrero de 1802.